Comparison of senescence progression in mesenchymal cells from human umbilical cord walls measured by immunofluorescence and flow cytometry of p16 and p21 / Comparação da progressão da senescência em células mesenquimais de parede de cordão umbilical humano medida por imunofluorescência e citometria de fluxo de p16 e p21

ABSTRACT Objective To follow the expansion of mesenchymal stem cells from umbilical cords by two classic senescence markers, p16 (INK4A) and p21 (CDKN1A), using practical, fast, and less expensive methods than the gold standard Western blotting technique, to evaluate its applicability in the laboratory. Methods Mesenchymal stem cells from umbilical cords were isolated from Wharton's jelly and, after quality control, morphological and immunophenotypic characterization by flow cytometry, were expanded in culture until coming close to cell cycle arrest (replicative senescence). Results A comparison was made between young cells, at passage 5, and pre-senescent cells, at passage 10, evaluating the protein expression of the classic cell senescence markers p16 and p21, comparing the results obtained by Western blotting with those obtained by flow cytometry and indirect immunofluorescence. Conclusion Follow-up of cell cultures, through indirect p16 immunofluorescence, allows the identification of mesenchymal stem cells from umbilical cord cultures at risk of reaching replicative senescence.

RESUMO Objetivo Acompanhar a expansão de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical por dois marcadores clássicos de senescência, p16 (INK4A) e p21 (CDKN1A), usando métodos práticos, rápidos e com custo menor do que a técnica padrão-ouro de Western blotting, para avaliar sua aplicabilidade em laboratório. Métodos Células-tronco mesenquimais de cordão umbilical foram isoladas da geleia de Wharton e, após controle de qualidade e caracterização morfológica e imunofenotípica por citometria de fluxo, foram expandidas em cultura, até chegarem próximas à parada do ciclo celular (senescência replicativa). Resultados Foi feita a comparação entre células jovens, na passagem 5, e células pré-senescentes, na passagem 10, avaliando a expressão proteica dos marcadores clássicos de senescência celular p16 e p21, comparando os resultados obtidos por Western blotting com os obtidos por citometria de fluxo e imunofluorescência indireta. Conclusão O seguimento de culturas celulares, por meio da imunofluorescência indireta de p16, permite identificar as culturas de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical em risco de atingirem a senescência replicativa.

Analysis of cytokine profile and growth factors in platelet-rich plasma obtained by open systems and commercial columns / Análise do perfil de citocinas e fatores de crescimento em plasma rico em plaquetas obtido por meio das metodologias do sistema aberto e colunas

ABSTRACT Objective: To evaluate growth factors and cytokines in samples of platelet-rich plasma obtained by three different centrifugation methods. Methods: Peripheral blood of six individuals with no hematological diseases, aged 18 to 68 years, was drawn to obtain platelet-rich plasma, using the open method and commercial columns by Medtronic and Biomet. The products obtained with the different types of centrifugation were submitted to laboratory analysis, including pro-inflammatory cytokines and chemokines by flow cytometry assays, the concentration of fibroblast growth factors-2 (FGF-2) and transforming growth factor-beta1 (TGF-β1). Results: The diverse separation methods generated systematically different profiles regarding number of platelets and leukocytes. The Medtronic system yielded a product with the highest concentration of platelets, and the open method, with the lowest concentration of platelets. The results of cytokine analysis showed that the different types of centrifugation yielded products with high concentrations of interleukin 8, interleukin 1β. The open system resulted in a product with high levels of interleukin 6. Other cytokines and chemokines measured were similar between systems. The product obtained with the open method showed higher levels of TGF-β1 in relation to other systems and low FGF-2 levels. Conclusion: The formed elements, growth factors and cytokines in samples of platelet-rich plasma varied according to the centrifugation technique used.

RESUMO Objetivo: Avaliar fatores de crescimento e citocinas em amostras de plasma rico em plaquetas obtidas por três diferentes métodos de centrifugação. Métodos: Foi coletado sangue periférico de seis indivíduos, sem doença hematológica, com idades entre 18 e 68 anos, para obtenção de plasma rico em plaquetas, utilizando o método aberto e sistemas comerciais das empresas Medtronic e Biomet. Os produtos obtidos com os diferentes tipos de centrifugação foram submetidos às análises laboratoriais, incluindo citocinas próinflamatórias e quimiocinas, por meio de ensaios de citometria de fluxo, concentração do fator de crescimento fibroblástico-2 (FGF-2) e fator de crescimento transformador-beta1 (TGF-β1). Resultados: As diferentes centrifugações geraram perfis sistematicamente diferentes referentes ao número de plaquetas e de leucócitos. O sistema da Medtronic originou produto com a maior concentração de plaquetas, e o método aberto com a menor concentração de plaquetas. Os resultados da análise de citocinas demonstraram que os diferentes tipos de centrifugação originaram produtos com elevadas concentrações de interleucina 8 e interleucina 1β. O sistema aberto resultou em produto com elevados níveis de interleucina 6. As demais citocinas e quimiocinas mensuradas foram similares entre os sistemas. O produto obtido com o método aberto apresentou níveis superiores de TGF-β1 em relação aos demais sistemas e reduzidos níveis de FGF-2. Conclusão: Os elementos figurados, fatores de crescimento e citocinas, em amostras de plasma rico em plaquetas, variaram conforme a técnica de centrifugação utilizada.

Salivary transforming growth factor alpha in patients with Sjögren's syndrome and reflux laryngitis / Estudo da concentração salivar do fator transformador de crescimento alfa em indivíduos com Sindrome de Sjögren e refluxo laringofaríngeo

Introduction: Saliva plays a key role in the homeostasis of the digestive tract, through its inorganic components and its protein growth factors. Sjögren's syndrome patients have a higher prevalence of gastroesophageal reflux disease and laryngopharyngeal reflux. Decreased salivary transforming growth factor alpha levels were observed in dyspeptic patients, but there have been no studies in patients with Sjögren's syndrome and laryngopharyngeal reflux. Objective: To compare the salivary transforming growth factor alpha levels of patients with Sjögren's syndrome and laryngopharyngeal reflux to those of healthy controls. Methods: This is a prospective controlled study. Twelve patients with Sjögren's syndrome and laryngopharyngeal reflux and 11 controls were prospectively evaluated. Spontaneous and stimulated saliva samples were obtained to establish salivary transforming growth factor alpha concentrations. Results: The salivary transforming growth factor alpha levels of patients were significantly higher than those of healthy controls. Five patients with laryngopharyngeal reflux also had erosive esophagitis; their salivary transforming growth factor alpha levels were comparable to controls. Conclusion: Salivary transforming growth factor alpha level was significantly higher in patients with Sjögren's syndrome and laryngopharyngeal reflux when compared to the control group. .

Introdução: A saliva exerce influência primordial na homeostase do sistema digestório, pelos seus componentes inorgânicos e pelos fatores de crescimento. Indivíduos com sindrome de Sjögren (SS) apresentam maior incidência da doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) e do refluxo laringofaríngeo (RLF). Concentrações salivares diminuídas do fator transformador de crescimento alfa (TGF-α) foram observadas em doentes dispépticos, porém não há estudos em populações com SS e RLF. Objetivo: Comparar concentrações salivares do TGF-α; de indivíduos com SS e RLF a de controles saudáveis. Método: Trata-se de um estudo prospectivo controlado. Doze pacientes com SS e RLF e 11 indivíduos controles saudáveis tiveram amostras salivares espontâneas e estimuladas coletadas para estabelecer concentração de TGF-α. Resultados: A concentração salivar de TGF-α; foi estatisticamente maior no grupo estudo para ambas amostras. Este aumento foi confirmado nos sete indivíduos do grupo estudo que não apresentavam esofagite erosiva quando comparados ao grupo controle, porém não houve diferença estatística da concentração de TGF-α; entre pacientes do grupo estudo que apresentava mesofagite erosiva em comparação ao grupo controle. Conclusão: A concentração salivar de TGF-α; foi estatisticamente maior no grupo de indivíduos com SS e RLF, sem esofagite erosiva. .

Evaluation of umbilical cord mesenchymal stem cells labeling with superparamagnetic iron oxide nanoparticles coated with dextran and complexed with Poly-L-Lysine / Avaliação da marcação de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical com nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro recobertas com Dextran e complexadas a Poli-L-Lisina

Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da marcação de células-tronco mesenquimais obtidas da parede da veia do cordão umbilical com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas recobertas com dextran e complexadas a um agente transfector não viral denominado de Poli-L-Lisina. Métodos: A marcação das células-tronco mesenquimais foi realizada utilizando as nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas recobertas com dextran complexadas e não complexadas a Poli-L-Lisina. As nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas recobertas com dextran foram incubadas com o Poli-L-Lisina em um sonicador ultrassonico a 37ºC por 10 minutos, para a formação do complexo através de interação eletrostática. Em seguida, as células-tronco mesenquimais foram incubadas overnight com as nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas complexadas e não com Poli-L-Lisina. Após o período de incubação as células-tronco mesenquimais foram avaliadas quanto à internalização do complexo nanopartícula de óxido de ferro superparamagnéticas /dextran/Poli-L-Lisina e nanopartícula de óxido de ferro superparamagnéticas /dextran através de ensaio citoquímico com azul de prússia. A viabilidade celular das célulastronco mesenquimais marcadas foi avaliada através do ensaio de proliferação celular utilizando o método de 5,6-carboxy-fluoresceinsuccinimidyl-ester e de morte celular através do método de anexinaiodeto de propídeo, ambos utilizando o recurso de citometria de fluxo. Resultados: Observamos nos ensaios citoquímicos que as célulastronco mesenquimais que foram marcadas com as nanopartícula de óxido de ferro superparamagnéticas /dextran sem a Poli-L-Lisina, não internalizaram com eficiência as nanopartículas devido pouca detecção de sua presença no interior das células. As células-tronco mesenquimais marcadas com o complexo nanopartícula de óxido de ferro superparamagnéticas /dextran/Poli-L-Lisina internalizaram com eficiência as nanopartículas devido à maior presença destas no interior das células. Os ensaios de viabilidade e morte celular demonstraram respectivamente que as células-tronco mesenquimais marcadas com as nanopartícula de óxido de ferro superparamagnéticas /dextran/Poli-L-Lisina continuam proliferando ao longo de sete dias e a porcentagem de células em apoptose inicial e tardia é baixa em relação à porcentagem de células vivas ao longo de três dias. Conclusão: Evidenciamos através de nossos resultados a necessidade da utilização da Poli-L-Lisina complexada com a nanopartícula de óxido de ferro superparamagnéticas /dextran para melhor internalização nas célulastronco mesenquimais. Paralelamente, demonstramos que este tipo de marcação não é citotóxico para as células-tronco mesenquimais já que os testes de morte e viabilidade celular mostraram que as células continuam vivas e proliferando.